Ứng dụng của đếm tế bào dòng chảy Flow Cytometry

Đếm tế bào dòng chảy là một công cụ hiện đại, cho phép phân tích nhiều đặc điểm của một, hoặc các quần thể tế bào trong dịch thể với một thời gian ngắn. Nguyên tắc của đếm tế bào dòng chảy dựa trên sự hấp thụ hoặc tán xạ ánh sáng và phát huỳnh quang, diễn ra khi một chùm tia laser chiếu vào các tế bào đơn lẻ, chuyển động có hướng trong một dòng chất lỏng. Sự tán xạ ánh sáng phụ thuộc vào cấu trúc bên trong của tế bào, kích thước và hình dạng của nó. Các tín hiệu tán xạ ánh sáng và/hoặc huỳnh quang, được ghi lại bởi một loạt các đi-ốt quang và được khuếch đại. Bộ lọc quang học có chức năng chặn ánh sáng không mong muốn, và cho phép ánh sáng có sóng mong muốn đến được bộ tách sóng quang. Các xung điện thu được sẽ được số hóa và dữ liệu được lưu trữ, phân tích và hiển thị thông qua hệ thống máy tính. Kết quả cuối cùng là thông tin định lượng về mọi tế bào được phân tích.

Phương pháp đếm tế bào dòng chảy đang được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán, theo dõi và tiên lượng bệnh, cũng như trong một số lĩnh vực nghiên cứu khoa học của y học như sinh học phân tử và tế bào, bệnh lý học, miễn dịch học, vi sinh vật…Một số ứng dụng lâm sàng được mô tả ngắn gọn ở các phần dưới đây:          

1. Chẩn đoán ung thư máu

Việc xác định và định lượng các kháng nguyên tế bào bằng các kháng thể đơn dòng đánh dấu huỳnh quang, còn gọi là kiểu hình miễn dịch, là một trong những ứng dụng quan trọng nhất của phương pháp đếm tế bào dòng chảy. Một số bệnh được chẩn đoán và phân loại dựa trên kiểu hình miễn dịch là bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh tăng sinh lympho mãn tính và u lympho ác tính. Chiến lược điều trị bệnh đó thường phụ thuộc vào các thông số kháng nguyên. Ngoài ra, phân tích kiểu hình miễn dịch cung cấp thông tin tiên lượng mà các kỹ thuật khác không có được, nó cung cấp một phương tiện nhạy, để theo dõi sự tiến triển của bệnh nhân sau hóa trị liệu hoặc ghép tủy xương, và thường cho phép phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu. Đếm tế bào dòng chảy về quá trình chết tế bào theo chương trình, kháng đa thuốc, thụ thể cytokin và các thông số khác, có thể cung cấp thêm thông tin chẩn đoán hoặc tiên lượng bệnh.

2. Xác định bệnh tồn dư tối thiểu

Bệnh tồn dư tối thiểu là sự tồn tại của các tế bào máu ác tính trong tủy xương, hoặc các mô khác ở bệnh nhân ung thư máu sau khi điều trị mà khó được xác định bằng các phương pháp đánh giá hình thái thông thường. Đây có thể là nguồn tái phát bệnh sau này. Có một số kỹ thuật phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu, mỗi kỹ thuật phải đáp ứng bốn tiêu chí, bao gồm độ nhạy (giới hạn phát hiện của ít nhất 10^-3 tế bào), tính đặc hiệu (khả năng phân biệt tế bào bình thường và tế bào ác tính), khả năng lặp lại, và khả năng ứng dụng (dễ dàng chuẩn hóa và thu thập nhanh chóng). Trong đó đếm tế bào dòng chảy được sử dụng như một phương pháp đơn giản, nhanh chóng để phát hiện bệnh tồn lưu tối thiểu. Mặc dù nó không nhạy bằng kỹ thuật PCR, nhưng nó cho phép phát hiện ở giới hạn 10^-2 đến 10^-4 tế bào, phù hợp hơn là đánh giá bằng hình thái tế bào.

Đếm tế bào dòng chảy sẽ phát hiện sự hiện diện của các đặc điểm kiểu hình miễn dịch khác thường, không phải là đặc trưng của quần thể tế bào bình thường trong mẫu đang nghiên cứu. Ví dụ: việc phát hiện tế bào có CD10⁺, TdT⁺ hoặc CD34⁺ trong dịch não tủy thì được chẩn đoán là bệnh tồn dư tối thiểu, vì các tế bào bạch cầu chưa trưởng thành này thường không có mặt trong dịch não tủy. Sự biểu lộ của TdT, CD3 ở bào tương, CD1a, hoặc kiểu hình kép CD4+ / CD8+ bởi các tế bào tủy xương được chẩn đoán là bệnh tồn dư tối thiểu trong bệnh ung thư lympho cấp tính tế bào T, vì các tế bào có các kiểu hình này chỉ có mặt trong tuyến ức. Đối với ung thư lympho cấp tính tế bào B thì khó khăn hơn, vì một số lượng nhỏ tế bào B chưa trưởng thành thường tồn tại trong tủy xương. Tuy nhiên, phần lớn các trường hợp ung thư lympho cấp tính tế bào B có các đặc điểm kháng nguyên không bình thường.

3. Phát hiện dưới nhóm lympho trong bệnh suy giảm miễn dịch

Đếm tế bào dòng chảy là công cụ để phát hiện một số bệnh suy giảm miễn dịch nguyên phát (bẩm sinh) và thứ phát (mắc phải). Trong suy giảm miễn dịch bẩm sinh có rối loạn ở một số loại tế bào, dẫn đến nhiễm trùng mãn tính hoặc tái phát, cơ thể không phát triển, nhiễm trùng bất thường… Trong suy giảm miễn dịch mắc phải không thể không kể đến suy giảm miễn dịch do HIV, sự thay đổi số lượng tế bào TCD4+ của bệnh này là một trong những tiêu chí đánh giá mức độ bệnh. Việc đếm tế bào dòng chảy có thể được thực hiện với 3 hay 4 màu. Phân tích ba màu thường được thực hiện với hai mẫu với các dấu ấn CD (CD45-CD3-CD4 và CD45-CD3-CD8) trong khi phân tích bốn màu được thực hiện với một mẫu duy nhất (CD45-CD3-CD4-CD8).

4. Đánh giá hiệu quả của hóa trị liệu ung thư

Trước khi điều trị, đếm tế bào dòng chảy là rất quan trọng để xác định sự biểu lộ kháng nguyên ở các tế bào bất thường. Trong và sau khi điều trị, phương pháp này đánh giá khả năng gắn của kháng thể vào kháng nguyên và theo dõi hiệu quả của việc loại bỏ tế bào ung thư. Để thực hiện được việc đó, cần có kháng thể đơn dòng chống lại kháng nguyên hoặc phân tử đích, lĩnh vực này đang ngày càng phát triển. Một số kháng thể ngăn chặn sự tăng sinh tế bào một cách trực tiếp bằng cách ức chế các thụ thể màng tế bào và các phối tử liên quan đến việc truyền tín hiệu. Loại dược phẩm đầu tiên là kháng CD3 (OKT3), được phát triển để ức chế miễn dịch dùng trong thải ghép tạng đặc. Sau đó là các kháng thể chống lại CD20, CD33, CD25, CD45 và CD52.

5. Đếm hồng cầu lưới

Hồng cầu lưới là loại hồng cầu ra máu ngoại vi 1 ngày trước khi chín, thay thế cho hồng cầu già chết đi. Bình thường hồng cầu lưới chiếm 0.5-1% số hồng cầu trong máu ngoại vi. Việc đếm số lượng hồng cầu lưới ở máu ngoại vi thường được thực hiện với mục đích đánh giá về chức năng của tủy xương. Tăng hồng cầu lưới xảy ra ở bệnh nhân thiếu máu có tủy xương bình thường, trong khi giảm bạch cầu lưới xảy ra ở bệnh nhân thiếu máu có suy tủy xương. Ngoài việc đánh giá sự thiếu máu, việc định lượng hồng cầu lưới cũng có giá trị trong theo dõi hoạt động tái tạo tủy xương sau khi hóa trị hoặc ghép tủy xương. Sự phân biệt hồng cầu lưới với hồng cầu trưởng thành dựa trên sự hiện diện của RNA và các chất khác trong hồng cầu lưới, những chất này bị mất đi sau khi biệt hóa thành hồng cầu trưởng thành. Để đếm hồng cầu lưới thường phải nhuộm RNA bằng hóa chất đặc hiệu và được đọc trên kính hiển vi ánh sáng thường. Phương pháp đếm hồng cầu lưới bằng đếm tế bào dòng chảy có độ chính xác và tiết kiệm chi phí hơn nhiều so với đếm thủ công và ngày càng được thực hiện trong phòng thí nghiệm lâm sàng. Ngoài ra, máy đếm tế bào dòng chảy cung cấp nhiều thông số bổ sung liên quan đến mạng lưới, chẳng hạn như chỉ số trưởng thành hồng cầu lưới (RMI) và phân số hồng cầu lưới chưa trưởng thành (IRF), có giá trị trong chẩn đoán lâm sàng và theo dõi tình trạng thiếu máu và các bệnh khác.

6. Ghép tạng và liệu pháp tế bào máu

Việc phát hiện các kháng nguyên tế bào và các chất sinh học rất quan trọng cho việc khám phá sinh học miễn dịch của việc chấp nhận và thải ghép và cơ chế hoạt động của các thuốc ức chế miễn dịch. Nếu không có thông tin thu được thông qua phân tích kiểu hình miễn dịch trong suốt thập kỷ qua, nhiều bí ẩn cơ bản của việc cấy ghép sẽ không được giải đáp, và việc ghép tạng sẽ không đạt được những thành công như hiện nay. Các ứng dụng lâm sàng của đếm tế bào dòng chảy trong ghép tạng đặc bao gồm đọ chéo trước khi ghép, sàng lọc kháng thể HLA và theo dõi kháng thể sau ghép. Trong ghép tủy xương, đếm tế bào gốc tạo máu CD34 trong máu ngoại vi hoặc mảnh ghép tủy xương tương quan với sự thành công của quá trình ghép và thời gian phục hồi tạo máu sau khi ghép tế bào gốc. Các ứng dụng khác của đếm tế bào dòng chảy trong ghép tủy xương bao gồm xác định trước khi cấy ghép về hiệu quả của sự giảm tế bào T ex vivo mô ghép và đánh giá miễn dịch sau cấy ghép phục hồi, đào thải mảnh ghép, bệnh mảnh ghép chống cơ thể chủ, và ảnh hưởng của bệnh lơ xê mi tới mảnh ghép.

7. Kháng thể kháng tiểu cầu

Tiểu cầu, một trong ba loại tế bào máu của cơ thể, được sinh ra từ tủy xương và có kích thước rất nhỏ. Tiểu cầu đóng góp vai trò quan trọng trong nhiều quá trình bao gồm đông cầm máu, tạo cục máu đông, co cục máu đông, co mạch và sửa chữa, miễn dịch, viêm, xơ vữa động mạch. Sự suy giảm tiểu cầu khiến cho các chức năng của nó không được đảm bảo và gây ra nhiều rối loạn trên lâm sàng. Có nhiều nguyên nhân gây suy giảm tiểu cầu, trong đó có kháng thể kháng tiểu cầu. Kháng thể này có thể nằm trong huyết tương, nhưng có thể đã gắn trên màng tiểu cầu. Đếm tế bào dòng chảy có thể phát hiện được các kháng thể này bằng các dấu ấn bề mặt như CD61, phối hợp với các kháng thể được gắn lên các hạt nhân tạo.

8. Các loại tế bào hiếm

Việc phát hiện các tế bào hiếm có giá trị trong nghiên cứu cơ bản, y học ứng dụng và chẩn đoán. Chẳng hạn, tế bào ung thư lưu hành trong máu, tế bào gốc ung thư. Đa số là có số lượng thấp trong dịch thể nên cần có các phương pháp làm giàu để phân tích tốt hơn. Trong quá trình phân tích cần lưu ý những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả như những mảnh vụn tế bào. Ví dụ, trong quá trình điều trị ung thư máu, việc xác định bệnh tồn dư tối thiểu các tế bào ung thư như đã mô tả ở trên thì phương pháp đếm tế bào dòng chảy là hữu ích.

9. Phát hiện HLA-B27

HLA-B27 là một phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC) lớp I. Các phân tử MHC lớp I là các glycoprotein bề mặt tế bào được biểu hiện trên hầu hết các tế bào có nhân. Sự hiện diện của kháng nguyên HLA-B27 có liên quan chặt chẽ với viêm cột sống dính khớp (AS), một bệnh viêm mãn tính của hệ thống cơ xương khớp như viêm khớp dạng thấp. Xét nghiệm HLA-B27 thường được sử dụng để sàng lọc AS kể từ khi 90% bệnh nhân mắc AS có kháng nguyên bề mặt HLA-B27 được so sánh chỉ 8% những người khỏe mạnh.

10. Ứng dụng trong vi sinh vật

Đóng góp nổi bật nhất của phương pháp đếm tế bào dòng chảy đối với vi sinh vật là khả năng phát hiện sự hiện diện của các quần thể vi sinh không đồng nhất với những đáp ứng khác nhau đối với các phương pháp điều trị kháng sinh. Một thiết bị đo tế bào cho vi khuẩn học trong phòng thí nghiệm, lý tưởng là phải rẻ tiền, vận hành đơn giản và sử dụng thuốc thử rẻ tiền. Mặc dù có những ưu điểm, nhưng việc áp dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy trên lâm sàng vẫn chưa phổ biến, có thể do thiếu khả năng tiếp cận với máy này hoặc thiếu kiến thức về tiềm năng của kỹ thuật này.

Tóm tắt

Đếm tế bào dòng chảy đã trở thành một công cụ thiết yếu trong việc chẩn đoán ung thư máu và ung thư lympho bằng cách hỗ trợ xác định sự tăng sinh tế bào có nguồn gốc là tế bào B hay tế bào T; và trong hầu hết các trường hợp, giúp chẩn đoán đặc hiệu nhờ sự có mặt của các dấu ấn đặc trưng. Ngoài ra còn có nhiều ứng dụng khác trong phân tích tế bào máu, tế bào trong dịch não tủy, phát hiện kháng thể… cũng như các tế bào nuôi cấy của nghiên cứu y học. Khả năng độc đáo của phương pháp phân tích tế bào dòng chảy là phân tích nhanh chóng, ngay cả trong các mẫu nhỏ, với đồng thời nhiều đặc tính tế bào như kích thước, độ phức tạp của bào tương, kháng nguyên bề mặt và nội bào, và hàm lượng DNA cho phép tăng độ nhạy trong phát hiện tế bào ung thư. Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng đếm tế bào dòng chảy là một phương pháp hỗ trợ cho lâm sàng và chẩn đoán tế bào bằng kính hiển vi.

Nguồn bài viết

TS.BS. Nguyễn Văn Đô – Trưởng Bộ môn Sinh lý bệnh – Miễn dịch – Đại học Y Hà Nội